Технология полимеразной цепной реакции (ПЦР) является основой бесчисленных исследовательских и испытательных лабораторий в различных областях, включая биомедицину, клиническую диагностику, микробиологическое тестирование пищевых продуктов и судебную экспертизу.Эта фундаментальная технология использует термоциклирование для облегчения серии реакций, в которых образец ДНК быстро и экспоненциально реплицируется с образованием миллионов или миллиардов копий последовательности.При приобретении новой системы ПЦР важно учитывать конечные цели вашего применения, точность и эффективность оборудования для термоциклирования, а также мощность и гибкость прибора.В этой статье представлен обзор различных опций и функций, доступных для систем ПЦР, чтобы помочь сузить подходящую систему для вашего приложения.
1. ПЦР против кПЦР против дПЦР
Хотя все системы ПЦР реплицируют ДНК с помощью полимеразной цепной реакции, разные системы используют разные методологии для достижения конкретных результатов.Среди этих различных методов - стандартная ПЦР, количественная ПЦР (кПЦР) и цифровая ПЦР (дПЦР).
Стандартные машины ПЦР обычно используются для амплификации ДНК для дальнейшего тестирования и использования;в некотором смысле эта технология используется как средство создания конечного продукта, а не как метод аналитического тестирования как таковой.Амплифицированную ДНК можно измерить только после завершения реакции ПЦР, а не в реальном времени, поэтому этот метод иногда называют ПЦР конечной точки.Конечный продукт традиционной ПЦР-амплификации обычно используется для последующего клонирования и секвенирования, а также может быть проверен с помощью гель-электрофореза для подтверждения присутствия целевых последовательностей и их относительного количества при низком разрешении (на основе интенсивности полосы).
Для более быстрого и точного количественного определения количества целевой последовательности, присутствующей в образце, количественная ПЦР (кПЦР), также известная как ПЦР в реальном времени, использует флуоресцентные зонды во время процесса амплификации для мониторинга количества ДНК, присутствующей после каждого термического цикла.Наблюдая за тем, сколько циклов необходимо для достижения определенного порога интенсивности флуоресценции, аналитик может определить количество ДНК в исходном материале при сравнении результатов со стандартной кривой.qPCR также может подтвердить наличие или отсутствие целевой последовательности быстрее, чем ПЦР конечной точки, и поэтому используется в диагностических приложениях, таких как обнаружение SARS-CoV-2 (с использованием обратной транскрипции для предварительного преобразования вирусной РНК в кДНК).
Цифровая ПЦР (дПЦР) — это еще один количественный метод, в котором реакции ПЦР происходят в тысячах отдельных реакционных камер, а абсолютное количество молекул ДНК в исходном образце можно определить на основе того, сколько реакционных камер дают флуоресцентный сигнал после завершения амплификации. .В отличие от кПЦР, флуоресцентные измерения не выполняются в режиме реального времени, и для количественного определения ДНК в образце не требуется стандартная кривая.Хотя dPCR обычно имеет ограниченную производительность и более высокие затраты, чем qPCR, он более точен, чувствителен и точен при количественном определении ДНК и особенно полезен в таких приложениях, как обнаружение редких мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов (SNP).
Решение о том, стоит ли выбирать конечную (качественную/полуколичественную) ПЦР по сравнению с количественным методом (кПЦР или дПЦР), относительно просто, когда вы рассматриваете свое приложение, но выбор между кПЦР и дПЦР может быть более тонким.qPCR является высокопроизводительным, экономически эффективным и достаточно чувствительным для многих приложений, но dPCR может быть лучшим выбором, если первостепенное значение имеет абсолютная количественная оценка с низкими пределами обнаружения.
2. Важность контроля температуры
Способность термоциклеров точно и эффективно регулировать и контролировать температуру образцов — это то, что обеспечивает успех реакций амплификации и должно быть в центре внимания при выборе любой системы ПЦР.Различные системы могут предлагать разные возможности в отношении скорости изменения температуры, однородности и точности температуры, а также способности достигать температурных градиентов между термоблоками для оптимизации метода ПЦР.
Скорость изменения температуры относится к скорости изменения температуры между этапами термоциклирования и в технических характеристиках прибора обычно выражается в градусах Цельсия в секунду (°C/сек).Производители могут предоставлять информацию о максимальных и средних скоростях изменения, а также различать скорости повышения (нагрев) и скорости снижения (охлаждение) прибора.В целом, более высокие скорости изменения соответствуют более быстрому времени работы, но покупателям следует с осторожностью относиться к максимальным скоростям изменения без изучения других показателей, связанных со скоростью инструмента.Прибор может достичь максимальной скорости изменения температуры только в течение короткого периода времени, а средняя скорость изменения температуры будет лучше отражать темп изменения температуры.Хотя характеристики скорости изменения скорости могут дать общее представление о том, насколько быстро могут работать определенные инструменты, по возможности ищите данные о фактическом времени работы, продемонстрированном на приборе, чтобы получить реалистичную картину того, как высокие скорости изменения скорости приводят к быстрому анализу.
Точность и однородность температуры также являются ключом к успешным реакциям, и хотя все термоциклеры предназначены для создания температур, необходимых для ПЦР, некоторые функции могут обеспечить более высокую степень уверенности, что имеет решающее значение для приложений, в которых образцы могут быть ограничены, а надежные результаты могут быть получены. первостепенное значение, например, в клинической диагностике и судебной экспертизе.Точный контроль температуры также имеет решающее значение при использовании аппарата ПЦР для чувствительных методов, таких как анализ плавления с высоким разрешением (HRM).Нагреваемая крышка может обеспечить лучшую однородность температуры по всей пробирке для ПЦР, поскольку без подогрева крышки образец может испаряться и конденсироваться в верхней части пробирки, где температура ниже.Конструкция термоблока также влияет на контроль температуры;Алюминиевые блоки являются наиболее экономичным вариантом, но они наименее проводящие, а это означает, что они будут достигать однородности температуры медленнее и будут иметь более низкую скорость изменения температуры, чем более проводящие блоки.Блоки с серебряным и золотым покрытием стоят дороже, но обеспечивают более быструю передачу тепла, обеспечивая равномерное распределение температуры по блоку.
Разным мишеням ДНК могут потребоваться разные температуры для достижения наилучших результатов амплификации;например, последовательности, богатые GC, требуют более высоких температур для денатурации.На идеальные температуры отжига также влияет ряд факторов: хотя температуры для этого этапа обычно выбираются на основе температур плавления праймеров, различия в температурах плавления между парами праймеров, а также влияние концентрации реагента, pH и концентрации соли могут все делают оптимизацию температурных условий реакции сложной задачей. Машины для ПЦР с возможностью температурного градиента предназначены для помощи в оптимизации методов ПЦР, позволяя тестировать несколько температур отжига за один проход.В зависимости от типов и разнообразия образцов, которые вы планируете анализировать с помощью вашего ПЦР-аппарата, выбор инструмента с возможностью градиента может стоить дополнительных затрат, чтобы сэкономить значительное время и оптимизировать новые протоколы реагентов за меньшее количество циклов.
3. Термоблоки
Как уже упоминалось, термоблок, используемый с инструментом ПЦР, может повлиять на контроль температуры, но конструкция блока – и конструкция прибора для размещения различных блоков – также влияет на пропускную способность, стоимость расходных материалов и гибкость.Типичные блоки выпускаются в формате с 96 или 384 лунками, хотя доступны и другие форматы, такие как 48 и 1536 лунок.Большее количество лунок обеспечивает более высокую производительность при меньших объемах реакции, что первоначально будет более дорогостоящим, но в конечном итоге снизит цену за реакцию из-за меньшего объема реагента, используемого для каждой лунки.Учитывая, сколько образцов вы будете обрабатывать и как часто вы будете использовать машину, будет зависеть от того, будет ли термоблок с меньшим или большим количеством лунок наиболее практичным и экономически эффективным для вашей лаборатории.
Некоторые инструменты поставляются с фиксированным форматом блоков, в то время как другие допускают использование взаимозаменяемых блоков, обеспечивая большую гибкость при переключении между форматами 96 и 384 лунок или между различными материалами блоков для разных применений.Некоторые термоциклеры также вмещают несколько блоков в один и тот же прибор, что позволяет одновременно использовать разные протоколы с разными наборами образцов.3 Блоки с «универсальными» размерами еще больше повышают гибкость при использовании пробирок, стрипов или ПЦР-планшетов разного размера. по мере необходимости.
Поскольку этот компонент играет ключевую роль в контроле температуры, обработке проб и производительности, при выборе термоциклера следует тщательно учитывать варианты термоблока.Для лабораторий с небольшим объемом проб или тех, которые регулярно проводят лишь несколько анализов, может быть достаточно недорогих приборов с фиксированным блоком стандартного 96-луночного формата.Однако модульные, гибкие инструменты могут оказаться выгодными для лабораторий с большим количеством протоколов, различными объемами проб и большим количеством пользователей, использующих один и тот же инструмент для собственных анализов, а также для лабораторий, которые могут захотеть расширить свою пропускную способность в будущем.
1. ПЦР против кПЦР против дПЦР
