Современные методы экстракции нуклеиновых кислот

Современные методы экстракции нуклеиновых кислот

ЧАСТЬ 1

Экстракция нуклеиновой кислоты (NAE) является одним из наиболее важных этапов молекулярной биологии, который обычно используется во многих областях биологических и медицинских наук, поскольку эта процедура является отправной точкой в ​​любом наборе молекулярной диагностики [1].Эта важнейшая процедура известна уже более столетия и существенно усовершенствовалась за последние десятилетия.Однако еще предстоит добиться определенного прогресса, чтобы протоколы NAE вышли из лабораторных условий в «реальный мир» диагностики на месте (POC-Dx).

В настоящее время известно, что внутриклеточные нуклеиновые кислоты (НК) можно разделить на геномные (или хромосомные), плазмиды и различные типы РНК.Хотя РНК содержат урацил, а ДНК — тимин, нуклеиновые кислоты обладают сходными основными биохимическими свойствами, но могут иметь совершенно разные трехмерные структуры (геномная, плазмидная, тРНК, мРНК, рРНК и т. д.).Однако, несмотря на структурные различия, наиболее часто используемые методы, описанные в настоящем тексте, могут быть применены к ДНК во многих ее организационных форматах (хромосомный, плазмидный и т. д.), а также к РНК и ее многомерным форматам (мРНК, рРНК, тРНК). , микроРНК и др.) с небольшими модификациями.

NAE можно грубо разделить на четыре этапа, которые можно модулировать в зависимости от образца и последующих приложений: (i) разрушение клеток;(ii) удаление мембранных липидов, белков и других нуклеиновых кислот, (iii) очистка/связывание нуклеиновых кислот из массы;и (iv) концентрацию нуклеиновой кислоты.

Разрушение или дезинтеграция клеток может быть достигнута физическими и/или химическими методами, основной целью которых является разрушение клеточной стенки и/или клеточных мембран.Методы разрушения в основном основаны на свойствах образца, и для этой цели используется широкий спектр инструментов и подходов как по отдельности, так и в сочетании для достижения разрушения тканей/клеток.Литические ферменты, хаотропные агенты и различные виды детергентов являются основными компонентами химического лизиса, тогда как механический метод разрушает клетки путем измельчения, сдвига, бисероплетения и шокирования.Интересно отметить, что если один метод не дает хороших результатов, другой может оказаться успешным.Методы осмотического шока в некоторых случаях дали лучшие результаты, чем обычные протоколы очистки NA, такие как фенол-хлороформная экстракция и измельчение шариков.Разрушение клеток важно не только для экстракции ДНК, но также играет решающую роль в биофармацевтической промышленности, поскольку с помощью этого процесса можно восстановить многие рекомбинантные белки и другие важные компоненты клетки.Другим подходом к разрушению клеток является использование различных методов в комбинации.Хорошим примером является ферментативный лизис, при котором во многих протоколах используются протеазы для освобождения NA от защитного белкового каркаса.Кроме того, решающее значение имеет инактивация клеточных нуклеаз, которые свободно переходят в раствор, чтобы защитить новую безбелковую НК.Комбинация детергентов и хаотропных солей в одном растворе используется для растворения клеточной стенки и/или клеточной мембраны и инактивации внутриклеточных нуклеаз.Механическое разрушение, с другой стороны, использует силу для извлечения компонентов клетки.Классическим примером измельчения в биологических науках является использование ступки и пестика, которое в настоящее время оптимизировано с использованием жидкого азота (если это разрешено образцом).Стенки клеток также могут быть разрушены ударными волнами, создаваемыми быстрыми изменениями давления, вызванными ультразвуковой обработкой или кавитацией.Другими механическими инструментами, доступными для разрушения клеток, являются сдвиг, при котором используется тангенциальная сила, чтобы проделать отверстие в клетке, и избиение шариков, при котором используются различные стеклянные или стальные шарики для разрушения жесткой клеточной стенки, как уже упоминалось..

Методы NAE включают экстракцию как ДНК, так и РНК, но в более широком смысле их можно охарактеризовать как химические или твердофазные методы;оба содержат четыре шага, упомянутые выше.В следующих разделах мы рассмотрим принцип работы и/или обоснование основных методов, используемых в настоящее время в биологических и медицинских науках.Поскольку молекулярная диагностика в значительной степени опирается на методы, которые начинаются с NAE, мы также обсудим некоторые основные функции устройств, доступных для POC-Dx, кульминацией которых станут проблемы и ограничения адаптации методов NAE к диагностическим тестам на месте оказания медицинской помощи.